熒光成像技術(shù)在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究中具有廣泛應(yīng)用，并在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用等領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。近年來(lái)爆炸式增長(zhǎng)的臨床前和臨床試驗(yàn)項(xiàng)目足以體現(xiàn)生物醫(yī)學(xué)熒光成像的重要性。相比于可見(jiàn)光，近紅外熒光(NIR, 700-1700 nm)成像具有更強(qiáng)的光學(xué)組織穿透能力和更低的生物自發(fā)背景熒光干擾，因而能夠提供更高的活體成像對(duì)比度，實(shí)現(xiàn)更靈敏、更準(zhǔn)確的活體檢測(cè)。近年來(lái)，復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系張凡教授課題組在提高熒光成像對(duì)比度、實(shí)現(xiàn)深層組織精確熒光成像方面做出了許多貢獻(xiàn)，例如，開(kāi)發(fā)長(zhǎng)波長(zhǎng)的近紅外二區(qū)稀土離子-分子配合物（Nat. Mater. , 2021, 20, 1571.）、實(shí)現(xiàn)近紅外二區(qū)長(zhǎng)余輝活體熒光成像（Nat. Nanotechnol. , 2021, 16, 1011）、近紅外二區(qū)生物熒光成像（Nat. Commun., 2020, 11, 4192）、近紅外二區(qū)熒光壽命活體成像（Nat. Nanotechnol., 2018, 13, 941）等。2023年1月，Nature Reviews Bioengineering雜志正式在線發(fā)表了復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系張凡教授研究團(tuán)隊(duì)綜述文章“Near-infrared luminescence high-contrast in vivo biomedical imaging” （圖1）。以提高活體熒光成像對(duì)比度為主線，該綜述系統(tǒng)回顧了近紅外熒光成像技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域發(fā)展過(guò)程中面臨的問(wèn)題并總結(jié)了相應(yīng)的解決思路與領(lǐng)域發(fā)展現(xiàn)狀。

圖1. 臨床醫(yī)學(xué)影像與熒光成像技術(shù)的發(fā)展

01熒光成像技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)

　　熒光成像是生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)模式中最簡(jiǎn)便且具有靈活性的手段，熒光染料的快速發(fā)展也促進(jìn)了多通道復(fù)合信號(hào)的快速實(shí)時(shí)檢測(cè)，使其在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中更具有吸引力。近紅外活體熒光成像技術(shù)近年來(lái)發(fā)展迅速，但仍面臨著多種問(wèn)題，其真正應(yīng)用于臨床影像和檢測(cè)的實(shí)例并不多。這些問(wèn)題主要來(lái)源于熒光或熒光分子與生物組織的相互作用，導(dǎo)致熒光成像對(duì)比度降低。生物組織并不透明，熒光在穿透生物組織過(guò)程中與組織和細(xì)胞相互作用，發(fā)生光子反射、吸收、散射等過(guò)程，造成熒光信號(hào)的衰減（圖2）。組織對(duì)熒光尤其是波長(zhǎng)為400-700 nm的可見(jiàn)光有明顯的削弱作用，并且這一作用是雙向的，即激發(fā)光和發(fā)射光都會(huì)在組織中衰減。于此同時(shí)，生物組織有含有發(fā)色團(tuán)的生物大分子組成，這些生物大分子在受激發(fā)光照射時(shí)，通常會(huì)產(chǎn)生熒光發(fā)射，稱為自發(fā)熒光，由此造成熒光成像的背景干擾（圖2）。另一方面，熒光成像對(duì)比度也取決于熒光探針在目標(biāo)組織的靶向和富集效率。人體具有非常完善的免疫防護(hù)機(jī)制能夠清除注射的外源物質(zhì)。盡管已有許多研究已經(jīng)報(bào)導(dǎo)利用特殊的配體修飾可以減少探針表面的蛋白吸附，從而減少被免疫系統(tǒng)識(shí)別清除。然而，配體修飾方法不能完全避免宿主清除，大多數(shù)的探針依然能夠被單核巨噬系統(tǒng)識(shí)別和捕獲。此外，人體不同的器官各自具有特殊的微觀結(jié)構(gòu)，對(duì)各種具有不同的理化性質(zhì)探針（尤其是納米探針）具有選擇通過(guò)性。熒光成像技術(shù)在臨床應(yīng)用受限很大程度上也歸因于目前所批準(zhǔn)的探針?lè)肿釉诨铙w中靶向效率欠佳（圖3）

圖2. 熒光在組織中的衰減與自發(fā)熒光

圖3. 注射熒光探針在活體中的運(yùn)輸屏障

02提高熒光成像對(duì)比度的途徑

　　1.優(yōu)化熒光探針的光學(xué)性能l熒光波長(zhǎng)活體成像的熒光信號(hào)實(shí)際是從組織內(nèi)部產(chǎn)生而非機(jī)體表面，根據(jù)成像位置的不同，熒光探針通常聚集在組織內(nèi)部距離表面深度從微米到厘米不等。平均自由光程（Transport Mean Free Path，TMFP）描述了光子在組織中沿直線傳播的距離，熒光在組織中的極限穿透深度可以由TMFP表述，超過(guò)TMFP的熒成像會(huì)導(dǎo)致圖像對(duì)比度低并且信號(hào)讀出不準(zhǔn)確。近紅外光（NIR, 700-1700 nm）由于組織吸收和散射低，相比可見(jiàn)光，具有更深的穿透深度。在相同的生物組織中，可見(jiàn)光穿透深度僅能達(dá)到微米級(jí)，而近紅外光則可以達(dá)到毫米甚至厘米級(jí)。此外，由于生物組織在近紅外窗口的自發(fā)熒光強(qiáng)度顯著降低，因此，近紅外窗口的熒光成像的背景更低，能夠?qū)崿F(xiàn)更高的對(duì)比度。尤其是近紅外第二窗口(NIR-II, 1000-1700 nm)成像，可以實(shí)現(xiàn)迄今最高的熒光成像對(duì)比度（圖4）。近年來(lái)，多種具有良好光學(xué)性能的NIR-II納米熒光探針被設(shè)計(jì)并用于活體成像。例如，單壁碳納米管(SWCNTs)、量子點(diǎn)（QDs）、鑭系下轉(zhuǎn)換納米顆粒（LnNPs）和金納米顆粒（AuNPs）等。然而，無(wú)機(jī)納米顆粒由于不可生物降解，在人體內(nèi)的長(zhǎng)期毒性仍然未知。為了解決這一安全顧慮，研究者們開(kāi)發(fā)了具有NIR-II發(fā)射的有機(jī)分子熒光探針（圖1.11）。盡管分子探針還不能取得與NIR-II無(wú)機(jī)納米顆粒相媲美的成像效果，但已開(kāi)發(fā)的NIR-II有機(jī)熒光分子，如CH1055、FD1080和LZ1105已經(jīng)在小鼠活體成像中展現(xiàn)出了比臨床批準(zhǔn)的ICG更好的熒光成像效果。

　　l熒光亮度亮度較低的熒光探針使用時(shí)需要更高的注射劑量、更大的激發(fā)功率或更長(zhǎng)的曝光時(shí)間，因而可能會(huì)導(dǎo)致更大的毒副作用、產(chǎn)生超出人體耐受范圍的熱負(fù)荷或丟失成像過(guò)程中的動(dòng)態(tài)信息。反之，亮度高的熒光探針具有更深的成像穿透深度，并且低激發(fā)光功率有助于削弱背景信號(hào)，能實(shí)現(xiàn)更高的成像對(duì)比度對(duì)于無(wú)機(jī)納米顆粒，由于發(fā)光機(jī)理不同，無(wú)機(jī)納米材料的亮度通常由顆粒的尺寸、摻雜劑、晶相、配體或剛性等因素決定。在納米結(jié)構(gòu)中引入核殼結(jié)構(gòu)來(lái)減少水分子對(duì)熒光的淬滅作用是一種對(duì)大多數(shù)納米顆粒通用的亮度提升策略。與有機(jī)熒光分子相比，無(wú)機(jī)納米材料通常有較高的量子產(chǎn)率和優(yōu)越的光穩(wěn)定性。但是對(duì)于NIR有機(jī)分子探針，由于其長(zhǎng)波長(zhǎng)通常來(lái)源于分子內(nèi)較大的共軛平面結(jié)構(gòu)，這也導(dǎo)致了分子在水溶液中穩(wěn)定性差、亮度低等問(wèn)題。一方面，可以通過(guò)在分子中引入空間位阻來(lái)減少分子間的相互作用以提高熒光分子的亮度。例如，在分子側(cè)鏈中通過(guò)共價(jià)鍵引入基團(tuán)增大熒光團(tuán)位阻，或者利用蛋白質(zhì)包裹疏水的熒光團(tuán)，通過(guò)超分子相互作用形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-熒光分子復(fù)合物。

　　l熒光斯托克斯位移斯托克斯位移的存在決定了熒光成像技術(shù)中探針內(nèi)在的二次濾波效應(yīng)，有助于實(shí)現(xiàn)更高的成像對(duì)比度。探針具有較小的斯托克斯位移會(huì)導(dǎo)致發(fā)射光子被分子重吸收并，由此導(dǎo)致分子熒光的自猝滅。此外，由于激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的重疊會(huì)導(dǎo)致有激發(fā)光和散射光引起的相關(guān)檢測(cè)誤差，降低檢測(cè)靈敏度和成像對(duì)比度。探針具有較大的斯托克斯位移可以避免熒光串?dāng)_，簡(jiǎn)化信號(hào)區(qū)分，更易實(shí)現(xiàn)多色成像。在對(duì)深部組織進(jìn)行熒光成像時(shí)，斯托克斯位移的作用尤其明顯。病變深度的變化對(duì)斯托克斯位移小的熒光探針有較大的影響。對(duì)于淺表組織的熒光成像，斯托克斯偏小（< 50 nm）但亮度高的熒光團(tuán)可以展現(xiàn)更高的成像對(duì)比度。相反，對(duì)全身或深層組織成像時(shí)，斯托克斯位移較大的探針（>100 nm）更具有優(yōu)勢(shì)。這主要是由于激發(fā)光在穿透厚組織時(shí)產(chǎn)生的背景熒光，小斯托克斯位移的探針由于內(nèi)在濾波效果差，產(chǎn)生的反射和散射光子容易造成強(qiáng)烈的干擾信號(hào)。 

圖4. 優(yōu)化熒光探針性能

　　2.降低活體組織熒光背景傳統(tǒng)的熒光成像技術(shù)需要實(shí)時(shí)的光激發(fā)，不可避免地導(dǎo)致了激發(fā)光散射和組織自發(fā)熒光。當(dāng)濾光片能有效地濾過(guò)散射光，則散射光對(duì)成像對(duì)比度的干擾很小，但實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中光學(xué)元件濾光效率難以達(dá)到100%。盡管組織散射和自發(fā)熒光在近紅外窗口的影響相比可見(jiàn)區(qū)有明顯衰減，但它們對(duì)成像對(duì)比度和檢測(cè)靈敏度的影響不可忽視，因此在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中需要加以考慮和應(yīng)對(duì)。近年來(lái)發(fā)展的無(wú)背景成像技術(shù)有效降低了成像背景干擾問(wèn)題。這些技術(shù)大體上可以分為以下三類（圖5）：

　　l延遲熒光成像通過(guò)調(diào)制檢測(cè)器和激光脈沖可以在去除激光光源后獲得探針的部分熒光信號(hào)。這種策略也被稱為時(shí)間門(mén)控成像技術(shù)。該技術(shù)成像對(duì)比度與熒光信號(hào)采集時(shí)間窗口有關(guān)，并隨著延遲時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)組織自發(fā)熒光完全衰減后可以實(shí)現(xiàn)最大成像對(duì)比度。因此，延遲熒光成像的對(duì)比度取決于熒光探針與組織自發(fā)熒光之間的壽命差距，探針的熒光壽命越長(zhǎng)，越容易實(shí)現(xiàn)高對(duì)比度成像。延遲熒光成像技術(shù)中引入約1 μs的延遲時(shí)間，就能夠完全消除組織的近紅外自發(fā)熒光。一種極限長(zhǎng)壽命發(fā)光現(xiàn)象，長(zhǎng)余輝發(fā)光（PL），指在停止激發(fā)后熒光可以持續(xù)數(shù)分鐘或數(shù)小時(shí)的光學(xué)現(xiàn)象。長(zhǎng)余輝成像與時(shí)間門(mén)控?zé)晒獬上裨诜椒ㄉ系膮^(qū)別在于前者不需要調(diào)制檢測(cè)器和激發(fā)脈沖。應(yīng)用近紅外PL活體成像相比于傳統(tǒng)基于實(shí)時(shí)激發(fā)的近紅外熒光成像方法，其成像對(duì)比度可以提高幾十至幾百倍。

　　l自發(fā)光成像生物發(fā)光（BL）存在于魚(yú)類、昆蟲(chóng)、藻類和植物中，是酶催化氧化發(fā)光前驅(qū)體并釋放光子的現(xiàn)象。由于不需要激發(fā)光，成像背景幾乎為零，已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞作用、蛋白質(zhì)相互作用、感染和腫瘤等研究領(lǐng)域。天然的生物發(fā)光底物熒光波長(zhǎng)在可見(jiàn)區(qū)，這一波段的熒光容易被組織吸收和散射，所以穿透深度有限。因此，改造生物發(fā)光底物使之波長(zhǎng)紅移到NIR窗口，增強(qiáng)生物發(fā)光的穿透深度，對(duì)于活體成像的實(shí)際應(yīng)用具有重要意義。另一方面，化學(xué)發(fā)光（CL）成像技術(shù)應(yīng)用與生物發(fā)光類似?；瘜W(xué)發(fā)光是化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的熒光發(fā)射現(xiàn)象?；瘜W(xué)發(fā)光由于獨(dú)特的發(fā)光機(jī)制（氧化還原反應(yīng)），可以用于檢測(cè)病變組織中過(guò)表達(dá)的活性氧（ROS）、活性氮(RNS)。與傳統(tǒng)的激發(fā)熒光成像不同，化學(xué)發(fā)光可以在檢測(cè)病灶原位生成，因而不受激發(fā)光漂白和背景干擾影響，具有比傳統(tǒng)熒光成像更高的檢測(cè)靈敏度和成像對(duì)比度。將自發(fā)光（BL、CL）底物與NI熒光分子混合包裹成膠束，使之形成生物熒光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET），將生物發(fā)光波長(zhǎng)延長(zhǎng)到近紅外區(qū)可以進(jìn)一步提高熒光穿透深度和成像對(duì)比度。

　　l使用其他激發(fā)光源生物自發(fā)熒光來(lái)源于短波長(zhǎng)光子與生物組織的相互作用。利用激光器之外的其他特殊光源可以減少這一現(xiàn)象從而降低生物背景熒光。例如，X-射線可以自由地穿透生物組織而不會(huì)引起散射和組織自發(fā)熒光。利用X-射線激發(fā)熒光探針使之發(fā)出近紅外熒光進(jìn)行生物檢測(cè)，可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)更深的組織穿透深度和更低的熒光背景信號(hào)。除X-射線外，切倫科夫輻射（CR）也可作為激發(fā)源用作熒光成像。PET成像用到的核素，例如18F、64Cu、68Ga、89Zr、90Y能夠發(fā)射β-粒子并發(fā)射出藍(lán)色的光，即切倫科夫光。但由于切倫科夫光波長(zhǎng)短，直接應(yīng)用于熒光成像時(shí)組織穿透能力差，且在組織中造成了自發(fā)熒光背景，很難用于實(shí)際活體檢測(cè)或手術(shù)導(dǎo)航。因此利用切倫科夫共振能量轉(zhuǎn)移（CeRET）策略，將核素與近紅外熒光探針結(jié)合，將切倫科夫光的波長(zhǎng)延伸到近紅外區(qū)以提高其組織穿透能力。在這種共振能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中，切倫科夫光扮演了原位激發(fā)的角色，相比于利用外置光源激發(fā)，這種原位激發(fā)策略不存在入射光衰減的影響。此外，由于熒光檢測(cè)器使用更靈活、更經(jīng)濟(jì)，開(kāi)發(fā)便攜式的熒光檢測(cè)器代替PET成像儀器能夠使疾病篩查更簡(jiǎn)便、成本更低。

圖5. 無(wú)背景熒光成像技術(shù)

　　3.局部組織成像靜脈注射造影劑是體內(nèi)發(fā)光成像最常用的給藥方法。但大多數(shù)探針可能會(huì)被免疫系統(tǒng)識(shí)別捕獲，造成嚴(yán)重的背景信號(hào)并降低成像對(duì)比度。

　　l調(diào)節(jié)探針的生物分布帶有特定靶向配體的探針可以靶向到細(xì)胞表面的受體，特異性配體如葉酸、葡萄糖、前列腺特異性膜抗原、多肽、適配體、抗體或蛋白等常被修飾在分子或納米探針的表面以實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向。除了利用靶向配體修飾探針外，還可以通過(guò)改變探針理化性質(zhì)來(lái)調(diào)控探針在活體中的代謝和分布（圖6）。例如，對(duì)于無(wú)機(jī)納米探針，超小納米顆粒（<5.5 nm）可以快速被腎臟清除，因此可以用來(lái)評(píng)估腎小球?yàn)V過(guò)率。通過(guò)改變有機(jī)分子探針的取代基團(tuán)可以改變其在活體中的代謝與分布，從而調(diào)控組織中的熒光信號(hào)分布及成像對(duì)比度。例如，設(shè)計(jì)分子結(jié)構(gòu)使其特異性分布在小鼠的甲狀腺、甲狀旁腺、外周神經(jīng)纖維、腎臟、腎上腺、腦垂體、骨頭、胰腺、淋巴結(jié)和腫瘤等。

　　l針對(duì)局部組織進(jìn)行特殊處理對(duì)成像組織進(jìn)行特殊預(yù)處理其目的一為提高熒光探針在局部成像組織中的富集濃度。一方面，由于單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)對(duì)外源藥物的清除有一個(gè)劑量閾值，超過(guò)這一閾值上限以外的顆粒能夠避免被Kupffer細(xì)胞捕獲。目前有多種材料包括碳納米顆粒(20-50 nm)、硫酸葡聚糖、氯化釓和氯膦酸脂質(zhì)體等，被證明能夠用于預(yù)注射以使MPS達(dá)到飽和狀態(tài)，從而阻斷MPS對(duì)熒光探針的捕獲，提高藥物的被動(dòng)靶向效率。另一方面，另外，也可以利用超聲和微氣泡形成的刺激擴(kuò)大血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙，增加腦血管或腫瘤血管的通透性以提高探針靶向效率。其目的二為降低局部組織的熒光背景。光學(xué)清除技術(shù)（又稱光學(xué)透明技術(shù)）可以去除組織中的脂質(zhì)和水分子等，使組織吸收和散射大大減少，同時(shí)輔助以匹配組織與成像環(huán)境的折射率，能夠降低組織的背景熒光并提高光的穿透深度和成像對(duì)比度。在活體中實(shí)現(xiàn)光學(xué)透明需要有高度安全性和生物相容性，因此透明過(guò)程必須具有可逆性?；铙w中使用的清除劑僅局限于生物相容性好的水溶液，如甘油、乙二醇、醋酸、糖、聚乙二醇和丙二醇等。

　　l可激活型熒光探針激活型探針的設(shè)計(jì)需要必須包含能夠響應(yīng)外環(huán)境刺激的結(jié)構(gòu)，能在特定的生物標(biāo)志物如金屬離子、酶、氧化還原環(huán)境或其他生物分子存在的條件下發(fā)生反應(yīng)和結(jié)構(gòu)變化，并體現(xiàn)出熒光強(qiáng)度、波長(zhǎng)或壽命等方面的顯著改變。由于探針通常也會(huì)在正常組織中滯留并造成背景信號(hào)，為了提高成像對(duì)比度，需要等待探針從正常組織中被清除之后才能更好地顯示病變組織和健康組織之間的區(qū)別。相比之下，可激活型熒光探針僅在含有特異的或過(guò)表達(dá)的生物標(biāo)志物的病變組織中顯示信號(hào)變化。目前研究較多的是基于熒光發(fā)射強(qiáng)度變化的激活型熒光探針，例如，利用腫瘤微環(huán)境的偏酸性條件來(lái)激活熒光探針，實(shí)現(xiàn)熒光從“關(guān)”到“開(kāi)”的轉(zhuǎn)變。這類熒光探針通常在血液中處于淬滅狀態(tài)，但在到達(dá)腫瘤部位后發(fā)生分解或結(jié)構(gòu)變化，同時(shí)伴隨著熒光強(qiáng)度的顯著提升。臨床上目前也正在嘗試?yán)媚[瘤部位的酸激活策略來(lái)提高成像對(duì)比度。

圖6. 局部組織成像

　　03 總結(jié)與展望

　　目前近紅外熒光成像的臨床試驗(yàn)主要聚焦在具有靶向性的NIR-I染料，如用ICG和IRDye 800CW標(biāo)記的生物分子等。NIR-II窗口的發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了熒光探針的進(jìn)一步發(fā)展，在優(yōu)化探針結(jié)構(gòu)的同時(shí)，檢測(cè)器的發(fā)展也需要齊頭并進(jìn)。此外，隨著生物工程與基因編碼技術(shù)的進(jìn)步，發(fā)現(xiàn)并解碼近紅外自發(fā)光蛋白或能推動(dòng)高對(duì)比度熒光成像與光遺傳學(xué)的快發(fā)展。

　　參考文獻(xiàn)：

　　Ying Chen, Shangfeng Wang and Fan Zhang*, Near-infrared luminescence high-contrast in vivo biomedical imaging, Nature Reviews Bioengineering, 2023, 1, 60–78