活體熒光成像不僅是臨床前研究中的一項常用影像技術，而且在近年來也逐漸被應用在臨床手術中。經靜脈或淋巴系統(tǒng)性遞送的特異性熒光探針可以在熒光成像模式下點亮疾病發(fā)生的部位，而無需事先了解病灶的位置。例如，利用吲哚菁綠作為熒光探針的一種手術導航方式已經在肝癌轉移灶的切除和乳腺癌前哨淋巴結的清掃等方面提供了實質性的臨床益處。然而，這些熒光探針的熒光是不可控的，常常因非特異性結合作用增加熒光背景，導致靈敏度不足。與之相比，可激活的熒光探針對疾病進展中的生物標志物，如蛋白酶、活性氧物種、弱酸性、低氧等有特異性反應之后才發(fā)光，可以減少因脫靶造成的背景信號，從而進一步提高成像對比度。然而在實際情況中，由于體內復雜和異質的生理環(huán)境，可激活的這一初衷通常在診斷多種疾病的能力方面受到損害和限制。尤其是，大多數探針傾向于與血液中無處不在的生物大分子（如血清白蛋白、脂蛋白）非特異性結合，這可能會觸發(fā)不需要的血液熒光背景并使探針的藥代動力學復雜化，導致在病灶部位中的保留時間較短。更重要的是，目前可用的可激活探針主要發(fā)射可見光（VIS；400-700 nm）和近紅外（NIR-I；700-900 nm）信號，這些信號可能會因組織異質性和深度位置而顯著衰減，進一步降低了成像的對比度。

　　研究團隊報道了一種細胞內吞激活的近紅外二區(qū)熒光探針，在活體小鼠的腫瘤和踝關節(jié)損傷炎癥的診斷方面獲得了高對比度的成像效果，有望為多種疾病的臨床前研究、臨床診斷和手術導航提供新的解決方案。

二區(qū)細胞內吞激活熒光探針的作用機制示意圖

　　溶酶體是細胞內吞過程末端的酸性細胞器（酸性pH在5-6左右），其中的物質被脂質膜包圍，其間高密度分布的酸性水解酶和分解代謝物（如游離脂肪酸和脂質）產生強烈的非共價相互作用環(huán)境。那么是否可以設計一種熒光探針只針對溶酶體這一特殊細胞內環(huán)境而開啟，從而有效的避免血液背景熒光的干擾，提高病灶部位的成像對比度呢？

　　近年來的研究表明，由于組織散射和自發(fā)熒光的降低，在波長為1000-1700納米的近紅外二區(qū)窗口成像可以顯著提高成像清晰度和信噪比。研究團隊首先從苯并噻喃菁和苯并吡喃菁兩種近紅外二區(qū)熒光染料母體出發(fā)，通過區(qū)域選擇性地引入具有溶酶體定位和酸性響應功能的哌嗪基團，分別構建了4個波長不同的近紅外熒光探針。近紅外二區(qū)細胞成像結果表明，4個探針均具有良好的溶酶體定位與染色能力。其中最大發(fā)射波長達到近紅外二區(qū)且在溶酶體酸性條件下具有較大熒光響應幅度的Lyso1005探針被選為模型探針進行了后續(xù)的改良設計。

圖 1溶酶體激活與定位的近紅外二區(qū)熒光探針的構建

　　研究人員合成了具有炔基官能團的Lyso1005探針，并通過點擊化學方法進一步修飾了親水性的聚乙二醇寡聚物。得到的探針被命名為CEAF（CellEndocytosis-Activated Fluorescent）探針，具有兩親性結構，在水溶液中因聚集而發(fā)生顯著的熒光淬滅，而當加入微量的表面活性劑Triton X100即可使探針重新恢復熒光，并且在溶液酸性達到pH = 5的情況下進一步產生熒光增強效應。整個過程總的熒光增強倍數達到了72倍，比未修飾的Lyso1005探針提高了17倍。此外，體外成像表明，探針在血漿、組織模擬液、細胞培養(yǎng)液等環(huán)境下均不能產生熒光，但細胞成像結果表明，CEAF探針可以選擇性的在溶酶體中被點亮。這一特性促使研究人員認為，探針的臨界聚集濃度受溶液中非共價相互作用和酸性pH的共同調控，其后被進一步利用實驗證實發(fā)現：酸性環(huán)境可以有效地提高探針的臨界聚集濃度，促使探針更容易在外界非共價相互作用下發(fā)生解聚。

圖 2 兩親性細胞內吞激活熒光探針的構建及其細胞內選擇性激活機制的研究

　　基于CEAF探針的溶酶體選擇性激活特性，團隊測試了其在腫瘤成像與手術導航中的應用。通過尾靜脈注射CEAF探針，小鼠CT26腫瘤可以被持續(xù)點亮超過36小時，并且點亮期間的腫瘤/背景信號比值持續(xù)超過Rose判據（信噪比大于或等于5是判斷某一信號是否為真實信號的判據）。活體顯微成像進一步證實，CEAF探針的熒光只出現在血管外的腫瘤區(qū)域。這一特性在腫瘤手術切除過程中顯得尤為重要，特別是在使用常亮探針作為對照組的手術導航實驗中，切除腫瘤產生的血液外滲使得手術區(qū)域出現了大面積的熒光污染，影響了后續(xù)腫瘤位置的鑒別。

圖3 紅外二區(qū)細胞內吞激活熒光探針在腫瘤成像與手術導航中的應用

　　為凸顯這一策略的通用性價值，研究團隊又在CEAF探針的基礎上進一步的修飾了RGD靶向基團，其可以與炎性M1型巨噬細胞上高表達的αvβ3受體特異性結合。通過構建小鼠踝關節(jié)損傷模型，研究團隊發(fā)現CEAF-RGD探針不僅能夠持續(xù)點亮關節(jié)損傷部位，而且可以對脾臟部位進行特異性的熒光成像。流式細胞術證實，損傷發(fā)生后，脾臟和關節(jié)損傷部位的M1型巨噬細胞均大量增多。上述結果表明了CEAF探針在細胞特異性成像方面的巨大潛力。

圖4 紅外二區(qū)細胞內吞激活熒光探針在細胞特異性的關節(jié)炎診斷中的應用

　　參考文獻：

　　Yue He+, Shangfeng Wang+*, Peng Yu+, Kui Yan, Jiang Ming, Chenzhi Yao, Zuyang He, Ahmed Mohamed El-Toni, Aslam Khan, Xinyan Zhu, Caixia Sun, Zuhai Lei and Fan Zhang*. NIR-II Cell Endocytosis-Activated Fluorescent Probes For In Vivo High-Contrast Bioimaging Diagnostics. Chem. Sci., 2021, 12, 10474–10482.